第三章
性激素测定的各种方法及其优缺点
本章节将简要介绍性激素检测的常用方法,分析影响因素及不同检测系统之间的比较。
(一)性激素检测的常用方法
1.放射免疫分析法(radioimmunoassay,RIA)
(1)该技术是将抗原、抗体反应的高度特异性与放射性核素检测技术的高度灵敏性相结合而建立的检测技术,提高了灵敏度,使免疫分析从定性变为定量,从常量分析提高到微量。
(2)样本用量少,操作简单,试剂成本低是RIA的优点。
(3)但该方法受放射性核素半衰期的影响较大,标记抗原或抗体的不断衰变使每次实验必须同时做标准曲线,不便于短期内发出报告。另外,由于放射性核素不可避免地污染环境,使其逐渐被淘汰。
2.酶联免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)
(1)酶取代放射性核素作为示踪剂,催化底物起到放大信息的作用。该法通过检测显色底物在酶催化下产生的吸光度值测定性激素。
(2)与放免法比较,其优点在于可利用存储的标准曲线。
(3)缺点是反应的底物有毒,酶不稳定,反应需要严格控制温度和p H。此外,该方法灵敏度和重复性低于放射性免疫分析。
3.化学发光免疫分析(CLIA)
(1)该方法将发光物质或酶标记在抗原或抗体上,经过免疫反应后,加入氧化剂或酶底物发光,通过检测发光强度实现样品的定量。
(2)既具有免疫反应的特异性,又有发光反应的高灵敏度,同时具备线性范围宽、标记物有效期长、操作简便、易于实现全自动化、减少人为操作误差等优势。
(3)缺点是试剂成本较高,仪器费用昂贵。
4.电化学发光免疫分析(electro-chemiluminescence immunoassay,ECLIA)
(1)该方法是继放射免疫分析、酶免疫分析、化学发光免疫分析测定以后的新一代标记免疫测定技术。它将电化学发光和免疫测定相结合,在电极上施加一定的电压或电流时,电极上发生电化学反应,在电极反应产物间或电极反应产物与溶液中某种组分之间发生化学反应而产生激发态,当激发态返回基态时产生化学发光现象。
(2)该方法具有标记物稳定、灵敏度高、重现性好、光信号线性宽等优点。
5.液相色谱-质谱联用(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS)
(1)LC-MS将高分离能力的色谱技术与高灵敏、高专属性的质谱技术联系起来,成为一种多用途、高灵敏的定性、定量分析方法。
(2)具有高灵敏度、高选择性、高效率、高可靠性等优点,常被作为激素测定的参考方法。
(3)但由于该方法对分析技术和仪器要求高,且仪器价格昂贵,操作复杂,目前未广泛应用于临床。
(二)不同性激素检测系统的性能比较和结果可比性
1.虽然液相色谱串联质谱法是目前可靠性最好的方法,但由于其仪器昂贵、操作复杂等原因未广泛应用。而放射性免疫和酶联免疫由于各自的局限性已经逐渐被淘汰,目前实验室多采用化学发光或电化学发光免疫分析测定性激素。
2.虽然不同化学发光分析系统的反应原理基本类似,但由于试剂成分的差异,尤其是抗体来源不同等原因,性激素检测尚无统一的溯源,未实现检测标准化。同一性激素项目在使用不同检测系统的实验室间检测结果不尽相同,可比性较差,这就提示临床医师应该了解性激素检测的基本性能及结果间的差异,在使用性激素检测结果时应该综合分析,对于治疗监测应尽可能选择相同的检测系统。
(三)性激素检测影响因素
1.受试者准备
(1)受试者应在平静、休息状态时采取坐位或卧位采样,此时性激素水平维持在相对稳定状态。
(2)恐惧、紧张、激动等状态均可导致患者激素分泌量增加,性激素水平相对升高。
(3)睡眠、寒冷状态时自身基础分泌低,导致检测结果下降。
2.样本采集时间
(1)性激素水平随女性月经周期呈规律性波动,故应根据诊疗需求确定不同的采样时间。
(2)性激素个体内变异较大,上午至中午维持较高水平,峰值约在早8点,下午至晚上降低。
(3)催乳素则每天早上8点开始下降,上午10~11点降至最低,下午2点又开始上升至第二天8点又开始下降。
(4)由于建立人群参考区间时通常是在清晨采样,故建议性激素检测也选择清晨、安静状态下采集样本。
3.样本处理和保存
(1)性激素检测需按检测系统说明书要求明确样本类型(血清/血浆),通常血清样本对结果影响较小。
(2)样本在采集、运送、保存时应注意做好标识并避免污染。
(3)样本采集后,尽快离心分离血清,并检测。
(4)样本在室温(15~30℃)下密封保存可稳定8小时;2~8℃冷藏保存可稳定至少72小时;-20℃以下冷冻保存,不同项目可稳定1周~1年。
4.溶血、黄疸、脂血样本对检测的影响
(1)溶血样本中红细胞及细胞器破裂,致使细胞内容物进入血中,会干扰PRL、LH、FSH、P和β-hCG的测定。
(2)脂血中乳糜微粒具有散射作用,对免疫比浊法等产生干扰,同时脂血使血清黏稠度增大,降低抗原抗体结合几率,或脂质占据一定体积使反应体积减少,导致放免法测定时结果偏低。
(3)黄疸样本含内源性过氧化物酶,对以辣根过氧化酶为标记物的ELISA法可能产生非特异性显色,影响检测结果。
5.自身免疫性干扰
如易嗜性抗体可与共轭化合物、酶或检测系统中其他试剂结合干扰免疫测定,LH等检测普遍受其干扰。
6.肥胖、药物、疾病等
(1)如绝经后肥胖女性游离E 2 水平比非肥胖女性高。
(2)含性激素的药物(如口服避孕药),LH、P峰值会受抑制。
(3)系统性红斑狼疮患者抑制LH的分泌及垂体对黄体生成素释放激素的反应造成雌激素分泌异常。